甲基化研究时，亚硫酸盐处理将未被甲基化的C转变成U，导致基因片段中存在U。高保真酶因为有修复错配的功能，所以扩增过程中遇到U时会将其认作错误碱基进行切断，导致反应无法继续进行。KAPA HiFi Uracil+是在KAPA HiFi的基础上进行了改造，使其在PCR反应过程中遇到U不会终止反应，保证反应的正常进行。

1、主要应用

(1)二代测序中甲基化文库扩增; (2)其他甲基化研究。

2、技术优势

(1)可扩增含U的基因片段;(2)快速、高效; (3)产物Bias少;

(4)可扩增高AT/GC模板; (5)文库覆盖度高。

3、产品特点

(1)dUTP的存在对扩增无影响

上图：实时荧光PCR扩增含Uracil体系，显示dUTP对KAPA Uracil+无抑制作用。用SYBR Green荧光定量PCR监测452bp基因的扩增情况，模板10倍梯度稀释(80pM-0.8fM)，一组含有0.2mM的dUTP，另一组不含dUTP。扩增用的试剂分别为KAPA HiFi、KAPA HiFi Uracil+。结果显示KAPA HiFi在dUTP存在的情况下显著被抑制，而KAPA HiFi Uracil+则不受影响制。

(2)高效扩增经过亚硫酸盐处理的人类全基因组文库

亚硫酸盐处理容易造成DNA损伤和降低DNA产物量。所以扩增时，因为抑制剂的存在、高A/T含量、DNA受损伤等因素叠加，导致了PCR产物量偏低、片段尺寸不合适、GC Bias等负面情况的发生。为了对比KAPA HiFi Uracil+与安捷伦的Pfu Turbo Cx，我们对比扩增亚硫酸盐处理之后的人类基因组文库，验证文库扩增产量和扩增Bias。

用KAPA文库制备试剂盒制备片段长度为200-400bp的人类基因组文库，模板为5μg人类基因组DNA。亚硫酸盐处理之后，用KAPA文库定量试剂盒进行定量，发现约2.7%未转化基因组DNA残留。分别用KAPA HiFi Uracil+和安捷伦Pfu Turbo Cx扩增未稀释的亚硫酸盐处理后基因组DNA，然后再Bioanalyzer2100上进行分析扩增产物，结果如下图所示。

上面3幅图所示：与安捷伦Pfu Turbo Cx相比，KAPA HiFi Uracil+扩增的文苦苦产量更高(图B)，扩增批次间Bias更少(图C)。扩增循环数分别为12、14或16个，产物的分析采用Bioanalyzer2100(图A)。

(3)扩增高A/T真菌全基因组文库

上图：与安捷伦Pfu Turbo Cx相比，KAPA HiFi Uracil+扩增产物量较高，片段尺寸相对较大。(Bioanalyzer2100分析)。

如上两图所示：与安捷伦Pfu Turbo Cx相比，KAPA HiFi Uracil+扩增甲基化文库优势明显，主要体现在覆盖深度以及扩增高AT/GC模板上。以上两图的结果为寄生虫基因组DNA经亚硫酸盐处理后，分别用安捷伦Pfu Turbo Cx和KAPA HiFi Uracil+扩增后经lllumina GAllx测序后的结果。

(4)人类甲基化测序：USC Epigenome中心用KAPA HiFi Uracil+评价人类基因组甲基化文库测序。KAPA HiFi Uracil+提高了人类基因组DNA甲基化测序的质量，尤其AT/GC含量较高的情况。

4、产品信息

产品价格： HiFi高保真酶（二代测序专用） KK2611 HiFi Hot Start for NGS 50 rxn 800 KK2612 HiFi Hot Start for NGS 250 rxn 3500 KK2701 HiFi Hot Start for NGS 50 rxn 2400 KK2702 HiFi Hot Start for NGS 250 rxn 10000 KK2801 KAPA HiFi  HS Uracil +ready Mix 50 x 50µL reactions 3000 KK2802 KAPA HiFi  HS Uracil +ready Mix 250 x 50µL reactions 14000 温馨提示：不可用于临床治疗。

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